摘要：

      通過“蛋白置換法”，可以分步實現尿液中銀離子的解聚和解吸附，有效解決銀離子非特異性吸附和嚴重殘留的難題，提高生物基質中金屬離子的提取效率，改善ICP-MS在金屬離子藥物中的藥代動力學檢測應用。
  

 前處理是檢測金屬離子的關鍵

      銀離子藥物的殺菌機理，是通過游離的Ag+結合細胞等微生物中蛋白質的自由疏基（可逆結合），改變蛋白表面電荷，使蛋白質變性而凝固，破壞細胞合成酶活性，細胞因喪失分裂增殖能力而死亡。

      大部分銀離子藥物的使用濃度趨近于痕量（低至μg/ml或ng/ml），無疑對銀離子濃度的檢測靈敏度和準確性提出了挑戰。電感耦合等離子體質譜法（ICP-MS）是檢測銀離子等金屬離子的首選，常應用于土壤、化妝品、水體、農作物、食品等基體干擾較低的基質中，如何有效的排除或降低尿液、血漿等生物基質中的銀離子檢測干擾，是開發相關檢測方法必須解決的問題。

      以尿液這類水溶液基質來說，它含有大量水分，少量無機鹽、尿素、尿酸等，以及含量很低的蛋白質和葡萄糖。在堿性尿液中，帶正電荷的銀離子極易吸附在表面帶負電荷的容器上（如玻璃、聚丙烯或聚苯乙烯），普通超聲處理和微波消解難以有效解除吸附。此外，由于膽汁排泄是消除銀的主要方式，而不是經腎排泄，如需從尿液中檢測到銀，需要前處理方法非常高效的富集極低濃度銀離子。

      當前的消解法等前處理方法主要局限在于：

      ①處理方法簡單，多采用硝酸一步直接稀釋，或增加固相萃取，但是銀離子極易吸附在管壁或者萃取柱上，解吸附效果差；

      ②解吸附的銀離子在富集過程中，易再次發生吸附而損失，次而產生殘留效應，難以適用于銀離子藥物的定量研究。因此，開發一種改進的生物基質中銀離子富集方法具有現實意義。

“蛋白置換法”前處理方法原理

      基于上述的尿液中銀離子富集難題，都正生物分析測試中心技術團隊開發了“蛋白置換法”前處理方法，利用蛋白-銀離子螯合物的聚合能力強于銀離子與管壁的非特異性吸附能力，同時，該螯合物又可以通過pH的改變實現聚合和解聚，實現對生物基質中銀離子進行高效富集，相關原理見下圖。實施過程包括：

      1）尿液樣本與少量稀硝酸經一定比例混合，改變尿液的pH值為弱堿性或中性，解吸附容器管壁上的大部分銀離子；

      2）加入一定量蛋白溶液，利用蛋白與銀離子等金屬物質在弱堿性或中性環境下的吸附作用力，遠大于容器管壁與銀離子吸附作用力的特征，1個蛋白分子可結合n個銀離子，置換結合容器管壁上、部分游離在溶液中的銀離子，形成蛋白-銀離子螯合物；

      3）加入適當倍率的稀硝酸，改變尿液的pH為酸性，解聚蛋白-銀離子螯合物，形成類似硝酸銀之類的易溶解型硝酸鹽，解離后的蛋白還可依靠空間位阻來阻斷銀離子與管壁的再吸附，獲得全部游離型銀離子；

      4）采用適當分離技術，將存在于倍率稀硝酸體系的游離型銀離子轉移到低吸附容器中，進樣檢測。

 ▲ “蛋白置換法”原理

方法準確度和精密度驗證

      對5種濃度質控品通過2天連續3批前處理，結合ICP-MS驗證本方法檢測尿液中銀離子濃度的準確度（回收率）和精密度（重復性）。結果表明：5個不同濃度銀質控品，各重復測定6次的準確度偏差不超過標示值的-2.61%~5.23%，均符合±15%之內的接受標準；各濃度下的銀質控品，6次測量結果批內、批間精密度CV%在0.76%~1.93%，均符合≤15%的接受標準，驗證了本方法的準確度和精密度符合PK定量要求。

小結

      都正生物分析測試中心利用銀離子在pH為弱堿性或中性時與蛋白的結合力更強于與容器管壁的結合力，蛋白-銀離子等金屬螯合物在堿性下結合、在酸性條件下完全解離的原理，摸索出“蛋白置換法”，有效解決了尿液中銀離子測不準，難重復的問題，方法驗證合格。

      目前，相關方法已形成技術專利且應用到實際樣本PK定量研究，同時結合臨床試驗聯盟、自主開發的LIMS信息化系統和嚴謹的數據統計團隊等自身優勢資源，更好的服務于臨床評價，歡迎咨詢合作。

參考文獻

[1] Lin YS, Rothen ML, Milgrom P.Pharmacokinetics of 38% topical silver diamine fluoride in healthy adult volunteers [J].J Am Dent Assoc，2019,150(3):186-192

[2] 長沙都正生物科技有限責任公司，一種生物基質中銀離子富集方法、定量試劑盒及檢測方法[P],2020105001519

作者：侯利平